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ELISA試驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果和假陰性結(jié)果解析
點(diǎn)擊次數(shù):631 更新時(shí)間:2024-11-13

    ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是目前臨床上常用的免疫學(xué)檢驗(yàn)方法,由于其試劑穩(wěn)定,易保存,操作簡(jiǎn)便,結(jié)果判斷較客觀,既適宜于大規(guī)模篩查試驗(yàn),又可用于少量標(biāo)本的檢測(cè),既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析,目前已廣泛用于微生物學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)、腫瘤學(xué)和細(xì)胞因子檢測(cè)等領(lǐng)域。

ELISA有敏感性高,特異性強(qiáng),重復(fù)性好的特點(diǎn),但其同時(shí)存在影響因素多的不足,現(xiàn)就實(shí)驗(yàn)操作中常見(jiàn)的影響因素進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn),以提高的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。

ELISA試驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果和假陰性結(jié)果解析
1、標(biāo)本的采集與保存
ELISA試劑盒當(dāng)標(biāo)本采集保存不當(dāng)產(chǎn)生溶血時(shí),紅細(xì)胞中的血紅蛋白釋放到血清中,血紅蛋白具有過(guò)氧化物酶的性質(zhì),其通過(guò)吸附或“PP效應(yīng)"(蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象)結(jié)合后,可催化A、B液顯色而造成假陽(yáng)性
標(biāo)本采集保存不當(dāng)致細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng);標(biāo)本在冰箱中保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致血清IgG聚合,易使間接法的試驗(yàn)本底加深。因此,標(biāo)本宜在新鮮時(shí)檢測(cè)。
反復(fù)凍融血清會(huì)使抗體效價(jià)跌落,所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測(cè),宜少量分裝凍存。
2、加樣
ELISA試劑盒如果 樣品稀釋液少加或血清多加,都會(huì)引起本底增高。對(duì)于間接法來(lái)說(shuō),受上述兩個(gè)因素影響更大。因?yàn)檠逯惺軝z的特異性IgG只有IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強(qiáng),非特異性IgG可直接吸附到固相載體上,有時(shí)也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標(biāo)二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽(yáng)性。如果加入的血清過(guò)多,高于規(guī)定的稀釋倍數(shù),極易造成高值陰性。反之,造成假陰性。
如果加入的酶結(jié)合物過(guò)多或加在較高的孔壁上或孔口,也會(huì)引起本底升高或假陽(yáng)性。
如果血液未開(kāi)始凝固或凝固不
時(shí)就強(qiáng)行離心分離血清,此時(shí)的血清中仍留部分纖維蛋白原,在ELISA測(cè)定過(guò)程中可以形成肉眼可見(jiàn)的纖維蛋白塊,易造成假陽(yáng)性結(jié)果。
3.  溫育
由于ELISA試劑盒試驗(yàn)在一定溫度下的反應(yīng)時(shí)間并不是反應(yīng)的終點(diǎn),溫育時(shí)間過(guò)短、溫度過(guò)低,易致顯色不全;溫育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、溫度過(guò)高,易致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,難以清洗
徹di,產(chǎn)生陰性高值或假陽(yáng)性反應(yīng)。因此,要嚴(yán)格按規(guī)定的溫度和溫育時(shí)間進(jìn)行。
由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍,因此我們每次試驗(yàn)時(shí)應(yīng)認(rèn)真觀察水浴箱的溫度,盡量少開(kāi)啟水浴箱門,嚴(yán)格控制水浴的溫度為37±0.5。同時(shí),微孔板不可重疊放置,以保證傳熱均勻,各板的溫度都能迅速達(dá)到平衡。
由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度,在這個(gè)溫度下溫育一定時(shí)間,蒸發(fā)的水分會(huì)很多,對(duì)于整個(gè)反應(yīng)體系來(lái)講,各種反應(yīng)物的濃度會(huì)不斷地增加,這樣必會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)zui后的值升高。因此溫育時(shí)應(yīng)貼上封板膠。

 


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